染色体病是先天性染色体数目异常或结构畸变引起的疾病。目前大多数染色体病尚无有效的治疗措施,这给家庭和社会带来严重的精神和经济负担, 因此, 对染色体病进行群体筛查并作出早期诊断(尤其是产前诊断) 有非常重要的意义。近年发展起来的分子细胞遗传学技术是细胞遗传学、分子生物学、分子免疫学相结合的产物,在染色体病临床诊断和研究中得到广泛的应用。在此简要介绍这一领域的研究进展。

(一) 传统细胞遗传学方法　又称染色体核型分析,此方法是将特定的细胞培养后,进行特殊制片染色和显带,在光学显微镜下观察分裂中期的染色体数目和结构,是确诊染色体病的基本方法。不同的检查目的,可采取不同的显带技术,主要显带技术:Q、G、C、R 带、高分辨显带技术等。染色体核型分析显带技术能准确观察染色体数目,诊断染色体畸变,对于染色体病患者能提供有价值的临床诊断依据。传统染色体检验技术是建立在对有丝分裂中期染色体染色吸收后所形成的显带图案分析的基础上,可检测到> 5 Mb 的染色体畸变。而对于< 4 Mb 的微小染色体缺失或畸变,受累区域染色体显带图案不易辨认。而由于实验过程和培养时间较长,仅能分析中期染色体等,使传统细胞遗传学技术受到了很大的限制。

(二) 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization , FISH)技术  FISH是20世纪80年代在细胞遗传学,分子遗传学和免疫学相结合的基础上发展起来的一种新技术,利用已知核酸序列作为探针,以荧光素直接标记或以非放射性物质标记后与靶DNA进行杂交,再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物,最后在荧光显微镜下观察杂交信号从而对标本中待测核酸进行定性、定位和定量分析。FISH 技术弥补了传统细胞遗传学分析方法的不足,使快速诊断染色体异常成为可能。Lawrence 等观察到两个DNA 探针间的实际距离与在间期核上的两个荧光信号间的距离相关,从而为间期核FISH提供了理论依据。1986 年Cremer 等分别证实了FISH 技术应用于间期核检测染色体非整倍体的可行性,从而开辟了间期细胞遗传学研究方法。使染色体病的诊断不再局限于中期分裂相,可从间期核中发现多种体细胞染色体的异常,即使细胞分散不好或有嵌合现象也可得到准确的诊断。Tepperberg等[用13、18、21、X 染色体特异性探针对5 348例妊娠妇女未培养的羊水间期细胞进行F ISH检测,可在羊膜腔穿刺24～48小时内快速诊断出这些染色体的非整倍体。5 197例有结果的, 占总数的97. 2% ,结果与常规核型分析的一致率为99. 8%。对于所有发现的非整倍体, F ISH的敏感性为99. 6% ,特异性99. 9%。目前用于FISH 的探针有: 重复序列探针、涂抹探针、单拷贝序列探针等。

FISH技术可以与未培养的间期核细胞杂交，省去了复杂的细胞培养及染色体分析过程，可在获取标本后24-48ｈ 出结果； 不仅能显示染色体中期分裂相，又可对间期核进行分析； 具有快速、准确、灵敏度高、特异性强等优点， 而且对嵌合现象也能做出准确的判断。但也有一定局限性， 受特异性探针的制约，FISH每次只能检测出1个或几个已知的染色体异常；某些亚家族DNA序列相互之间非常接近，在数对染色体中心着丝点序列之间可发生交叉反应； 且技术复杂、操作繁琐、试剂昂贵，不适合临床大规模地开展。因此， FISH技术不能完全替代染色体核型分析， 而应与其相结合对染色体病进行诊断。

(三) 多色荧光原位杂交(multiplex - FISH , M-FISH) 技术　M-FISH是在FISH 基础上发展起来的新技术, 它不仅具有FISH的优点,且克服了FISH的局限性,能同时检测多个基因、分辨复杂的染色体易位等,是一种有较大发展前途的分子细胞遗传学技术。M-FISH和FISH 技术的原理大致相同,都是依据碱基互补原理,用荧光素直接或间接标记的特异核酸探针,在染色体标本上对待测核酸靶进行分析。不同的是, M-FISH一次杂交即能检测多个基因靶位,各靶位在荧光显微镜下的颜色不同,呈现多种色彩。Hanson 等用不同颜色分别标记不同探针,对同一细胞进行M-FISH ,可同时检测出多种染色体异常。van Humelen等用M-FISH同时检测染色体数目和结构的异常,一次杂交即可检测三倍体、1 号染色体短臂末端的复制和缺失、涉及1号和8 号染色体的非整倍体等多个项目。

M-FISH 克服了常规FISH单一细胞诊断的局限性,增加了可检测的染色体数目,短时内得到了更多的遗传信息。Speicher 等用不同的荧光染料组合标记不同的染色体,经计算机图像分析系统,同时显示了人类所有24 条染色体的FISH 图像。利用24色FISH 方法标记每一对染色体为一特殊颜色,应用到染色体亚端粒筛选,会使整个分析过程简便化。M-FISH 也可以检出染色体微小易位,对G显带核型分析不易辨认的隐蔽性异常作出明确诊断,是染色体核型分析方法的有力补充技术。随着技术的成熟、探针种类的丰富、图像分析技术的发展,M-FISH 的过程将更加简捷,应用将更为广泛,成为染色体病诊断的重要辅助手段。

(四) 比较基因组杂交( comparative genomic hybridization ,CGH) 技术  比较基因组杂交是FISH的衍生技术，其基本原理是用红色荧光标记物来标记来自正常个体的DNA，用绿色荧光标记来自未知标本的DNA，二者等量同时加到一个含有正常核型男性的中期相染色体玻片上竞争抑制共杂交。如果正常基因组和检测者完全相同，结果将是黄色荧光。如果与正常比较未知者有多余部分（例如三体性），则会出现绿色荧光区域。如果存在缺失，则应出现红色荧光区域，该传统的比较基因组杂交可以一次分析全部染色体，但是常常因为染色体的交叉重叠而不利于分析，近年来出现的微阵列－ 比较基因组杂交（Array-CGH）是将基因芯片和CGH相结合的一种分子细胞遗传学技术，其用微阵列取代传统CGH的中期分裂相， 使荧光标记的测试探针和参照DNA探针竞争性地与微阵列上的短片段靶序列杂交。可明显缩短杂交时间。同时也能分析单基因的突变的情况,将比较基因组杂交的分辨率从2-10Mb提高到100-200kb。其操作过程可以由计算机自动控制,结果获取快速直接,实现了自动化。Schaeffer等运用Array CGH技术检测了41例妊娠流产产物,结果显示Array CGH不仅可检测出所有已知的,且被G显带证实的染色体异常,还发现了4例G显带不能鉴别的染色体异常。

CGH能够检测数百Kb 至数Mb 的DNA 扩增或缺失,是研究整个基因组DNA 获得与缺失的非常有应用前途的分子细胞遗传学技术。但它不能显示出染色体易位、倒位及其他不改变染色体数目的异常变化。近几年,Southern 印迹、FISH、流式细胞仪等技术与CGH 结合应用,从而有助于克服这些缺点。

(五) 引物原位标记(Primed in situ labeling , PRINS) 技术　PR INS(p rimed in situ labeling)技术由Koch等于1989年首先建立,其基本原理是在退火的温度下,把已变性的染色体DNA与未标记的寡核苷酸引物特异性结合,在DNA聚合酶催化下,以标记的脱氧核苷酸为底物,在合适的温度下,进行延伸反应,合成含有标记的DNA链。标记的DNA链通过相应的检测系统被检测。PR INS将F ISH的特异性与PCR的敏感性相结合。近年来又建立起了快速引物原位标记技术,使PR INS技术更加迅速简单,并可实现半自动化。该技术最大的优点是采用温热循环器,使退火温度和延伸反应温度可精确至0. 1℃,从而使引物与靶序列间退火的严谨度更高;同时采用Taq酶以及荧光素212-dUTP,使反应更加快速,且能直接观察到实验结果。现在在快速PR INS基础上又提出闪电技术,该技术可在2～3分钟获得重复序列的标记信号。

PRINS 技术在染色体病诊断研究中,可直接在间期核中进行,不仅能为判别易位、缺失等重排类型、来源和断裂点提供可靠的依据,而且能鉴别一些环状染色体、双着丝粒染色体及其他畸变染色体。PR INS技术的操作较F ISH更为快速简捷, 所采用的寡核苷酸引物价格低廉,更适宜在国内推广应用。但对标本要求较高,反应条件不易掌握,且需要专门的仪器进行反应。PRINS 的出现极大推动了染色体病诊断技术的发展，从而为染色体病的临床诊断开辟了一条新途径。